Как определить число копий контрольного гена?
По мере ознакомления с инструкциями к наборам у меня возникли вопросы, которые хотелось уточнить:
По набору реактивов ОНКОСКРИН 3-2-3Q для выявления интенсивности экспрессии химерного онкогена человека MLL/AF4 типов е11е5 и е11е4 методом ПЦР в реальном времени по технологии TaqMan:
В инструкции объясняется: «Относительная экспрессия гена MLL/AF4 в образце определяется как:
Среднее число копий гена MLL/AF4 / среднее число копий гена ABL* х100% * - вместо гена ABL может использоваться любой контрольный ген (ген домашнего хозяйства - BCR, GUSB, β2 микроглобулин и др.)».
К сожалению, мне не удалось понять, как определяется среднее число копий гена ABL и как вместо него можно использоваться любой контрольный ген (ген домашнего хозяйства - BCR, GUSB, β2 микроглобулин и др.)
Для определения экспрессии гена ABL используется набор реактивов ОНКОСКРИН 14-Q, среднее число копий гена ABL вычисляется исходя из значений числа копий в каждом повторе (2 или 3 повтора).Таким образом, для определения относительной экспрессии гена MLL/AF4 (как и любого другого химерного гена) определяется среднее число копий гена MLL/AF4 с помощью набора ОНКОСКРИН 3-2-3Q и среднее число копий гена ABL с помощью набора ОНКОСКРИН 14-Q. Набор для определения гена ABL универсален и может использоваться с любыми другими наборами для определения экспрессии химерных онкогенов. Для других контрольных генов также существуют отдельные наборы реактивов (ОНКОСКРИН-12Q для β2 микроглобулина и ОНКОСКРИН-13Q для гена GAPHD).
Для проведения количественной оценки химеризма после ТКМ используются компьютерные программы, позволяющие сравнивать интенсивность полученных после электрофореза фрагментов. Можно, в частности, использовать программу Phoretix 1D , которая сравнивает интенсивность полос в изображениях электрофореза, сохраненных в формате tiff. Такая оценка не является, конечно, абсолютно количественной и для ее применения нужно, как минимум, использовать в ПЦР реакции одно и тоже количество ДНК.