ПЦР в реальном времени

Метод количественной ДНК-диагностики,  использующий принципы классической ПЦР, но с возможностью измерения абсолютного и относительного измерения копий ДНК в образце. Количество  ДНК измеряется в реальном времени после каждого цикла амплификации. Детекция накопления продуктов реакции (ампликонов) может измеряться двумя способами:

• неспецифически, с помощью интеркалирующих  флуоресцентных красителей (напр. SYBRGreen, SYBR Gold)
• с помощью олигонуклеотидов с флуоресцентными метками (повышает специфичность реакции); этот способ используется чаще.

Кривая накопления продуктов реакции отражает 3 стадии: инициации (базовый уровень сигнала), экспоненциальную (накопления продукта) и стадию насыщения, когда график выходит на «плато». Пороговое значение флуоресценции обычно устанавливают выше базового уровня. Номер цикла, при котором флуоресценция превышает фиксированный порог, называют пороговым циклом.

Преимущества ПЦР в реальном времени (по технологии TaqMan):

• Существенное повышение специфичности метода за счет наличия внутреннего зонда;
• Количественное определение в реальном времени
• Снижение риска контаминации (за счет все стадии ПЦР проводятся я в одной пробирке и отсутствие стадии электрофореза)
• Возможность создания мультиплексных систем, позволяющих детектировать несколько генов в одном образце(реакция в одной пробирке)
• Снижение времени проведения реакции
• Повышенная чувствительность и расширенный динамический диапазон (до двукратного изменения начального количества ДНК)

Метод широко используется в научных исследованиях  и диагностике (оценка экспрессии генов, генотипирование, мониторинг эффективности терапии, наличие инфекционных агентов и др.)